MECANISMUL DE ACTIUNE SI MECANISMUL APARITIEI REZISTENTEI IN TRATAMENTUL CU INHIBITORI AI TYROSINE-KINASELOR

Dr. Medic POPESCU IULIAN  

Secţia clinica de radiobiologie Institutul Clinic Fundeni,Bucuresti

e-mail: popdociul@yahoo.com

 Dr. HALPERN ALINA medic primar Spitalul de Pneumoftiziologie "Sf. Stefan" Bucuresti

 

 REZUMAT

Din anul 2000 a început o eră nouă în tratamentul Adeno-carcinomului pulmonar (ADC), care va ameliora, va diversifica, va îmbogăţi tratamentul chimioterapic al Cancerului pulmonar (CP) acesta devenind un tratament ţintit pentru o boală heterogenă. Inhibitorii de tyrosine-kinase (ITK) au efect numai asupra ADC cu mutaţii EGFR

Cele mai frecvente mutaţii sunt la nivelul exonului19 prin deleţii şi la nivelul exonului 21 prin mutaţii punctiforme (T858R)

Mutaţiile şi kopiile EGFR după stimulare de liganzi suferă o homo sau o hetero-dimerizare, care duce la auto-fosforilarea grupului ATP/EGFR, care la rândul lui activează căile: PI3K/AKT, JAK/STAT şi Ras/MAPK care în continuare duc la creştere celulară, supravieţuire şi proliferare. ITK blochează

fosforilarea ATP-EGFR ducând la creşterea apoptozei celulare. Dar, după o perioadă de tratament a apărut rezistenţa la ITK prin apariţia mutaţiei T790M şi amplificarea c-MET. Acestea duc la activarea altor căi de semnalizare, refăcând creşterea celulară. Acest lucru a fost posibil datorită legăturii reversibile a ITK cu ATP-EGFR. Astfel au apărut inhibitorii ireversibili, o nouă etapă în tratamentul acestui sub-set al ADC, care sunt în curs de experimentare.

Cancerul Pulmonar (CP) cuprinde 2 grupări principale: cancerul pulmonar fără celule mici şi cancerul pulmonar cu celule mici.

În cadrul cancerului pulmonar fără celule mici avem 3 seturi: adeno-carcinomul (41-.43%), forma squamoasă (30%) şi cancerul cu celule mari.

În majoritatea tumorilor ale CP fără celule mici, EGFR (receptorul factorului de creştere epidermal) este foarte exprimat (2). Acest lucru se asociază cu o dereglare şi a altor căii de semnalizare, care promovează creşterea tumorii şi influenţează prognosticul.

Devine astfel raţională terapia ţintită cu inhibitori ai tyrosine-kinaselor (ITK) sau terapia cu anticorpi anti-EGFR ca Cetuximab (1)

Primii inhibitori ai ai tyrosine-kinaselor au fost gefitinib (Iressa) şi erlotinib (Tarceva).

Ei au putut fi implementaţi datorită eficacităţii acţiunii lor, sunt medicamente cu molecule mici, sunt reversibili şi au o toxicitate redusă (2, 3).

Acţiunea acestor 2 inhibitori ai tyrosine-kinaselor s-a precizat într anii 2002-2004 (1, 4, 5, 6) care au demonstrat asocierea între mutaţiile EGFR şi răspunsul la tratamentul cu gefitinib în cancerul pulmonar fără celule mic(4, 5, 6)

MUTAŢIILE EGFR

Genelor precum şi cromozomilor, care de regulă sunt constante, le apar uneori variaţii bruşte, care se numesc mutaţii. Aceste mutaţii se întâmplă fie unei singure gene, fie schimbării cromozomului. Mutaţiile duc la câştigul unor proprietăţi funcţionale. Cel mai frecvent se găsesc în cancerul pulmonar fără celule mici şi mai rar în cancerul de ovar, colon colangiocarcinom (4).

Activitatea celor 2 ITK este posibilă numai în cazul apariţei mutaţiilor la nivelul EGFR. Mutaţiile cresc susceptibilitatea la tratamentul cu ITK, care duce la moarte celulară (1, 7, 8).

Locaţia mutaţiilor relevante clinic.

Mutaţiile punctiforme G719S şi L858R, precum şi mutaţiile prin deleţii la nivelul exonului 19 sunt asociate cu sensibilitate la acţiunean inhibitorilor de tyrosine-kinase.

Mutaţiile prin inserţie în exonul 20 sunt asociate cu rezistenţa primară. În schimb mutaţia punctiformă T790M este o mutaţie secundară şi este asociată cu rezistenţa la inhibitorii de tyrosine-kinase

Localizare.

Mutaţiile EGFR apar între exonul 18 şi exonul 21. Mutaţiile sunt de două feluri:

• prin deleţii la exonul 19 în procent de 45%;
• prin mutaţie punctiformă în exonul 21 în procent de 40% (L858R).

Cele mai comune sunt în exonul 19 (9).

Frecvenţă.

Frecvenţa mutaţiilor a predominat la est-asiatici 30-40% şi 10-15% la europeni (8-5), iar după alţi autori a fost între 25-50% la est asiatici şi 10% la Europeni şi USA (7). Nu se ştie cauza acestei deosebiri.

Mutaţiile sunt mai frecvente la femei, nefumători şi adeno-carcinomul pulmonar (10).

Frecvenţa mutaţiilor predomină în Adeno-Carcinom 53% (115 cazuri din 215).

În Adeno-Carcinom mutaţiile au fost asociate cu:

nefumători 74% (83 cazuri din 111);

femei 66% (87 cazuri din131) (11).

Gradul de diferenţiere histologic a fost:

bine diferenţiat 63%(55 cazuri din 86);

slab diferenţiat 31% (11 cazuri din 41).

Frecvenţa mutaţiilor scade cu creşterea numărului de ţigarete:

nefumători 74,8%;

pasivi 61,1%;

foşti fumători 35,7%;

fumători activi 19%.

Deasemeni 13% au fost mutaţii duble (11).

Mecanismul de acţiune al mutaţiilor EGFR

Tumorile cu mutaţii EGFR sunt dependente de semnalizarea EGFR pentru creştere, supra vieţuire şi proliferare (2,12).

Proteina EGFR este membru al familiei Erb tyrosine–kinase. Alături de proteina EGFR un rol important îl mai au ErbB2 (HER2) şi ErbB3.

EGFR după stimulare de liganzi suferă o homo sau o hetero- dimerizare, care duce la auto-fosforilare a grupului ATP/EGFR. În continuare sunt activate alte proteine de semnalizare intra celulare (10, 13).

Sunt mai multe căi de semnalizare, care operează şi includ căile: Ras/MAPK, PI3K/AKT, JAK/STAT (10, 13). Activarea lor duce la creştere celulară, supravieţuire, proliferare.

În acest mecanism mai contribuie şi ErbB2 (Her2) şi ErbB3.

ErbB2 (Her2). Asocierea Her2 cu mutaţiile EGFR creşte semnalizarea ErbB3 (10). Deasemeni Her2 prezice sensibiliatea la tratamentul cu ITK în cancerul cu mutaţii EGFR (10-14 )

ErbB3 este fosforilat de tyrosine-kinase şi contribuie la activarea căilor de semnalizare (down-streams) secundare în cancerul sensibil la tratamentul cu ITK/EGFR. În experiment s-a observat şi o corelare între sensibilitatea la ITK şi expresia ErbB3 (10, 15, 16, 17).

Prezenţa mutaţiilor, activarea căilor de semnalizare (PI3K-AKT), asocierea ErbB2 (Her2) cu mutaţiile EGFR şi expresia ErbB3 - toate cresc sensibilitatea la tratamentul cu ITK-EGFR

În realitate însă sunt şi cancere pulmonare în care EGFR nu controlează aceste căi, ceea ce face ca administrarea de ITK să devină ineficientă. Aceste alte căi duc la activarea căilor de semnalizare secundare făcând ineficient tratamentul cu ITK şi apare asfel rezistenţa la tratament.

COPIILE (AMPLIFICAREA) EGFR

Alături de studiul mutaţiilor EGFR, s-a reuşit să se obţină şi numărul de copii ale genei EGFR. Acest lucru a devenit posibil prin apariţia metodei FISH (fluorescence in situ hybridisation) care evidenţiază numărul de copii ale genei EGFR (1, 19).

Aceste date s-au corelat cu creşterea sensibilităţii la ITK(1, 19, 20).

Numărul de copii crescut se consideră dela 3 sau mai multe copii.

Asocierea numărului de copii cu mutaţiile EGFR creşte răspunsul la tratamentul cu ITK. Asfel:

- pacienţii FISH pozitivi (nr. crescut de copii) au avut o creştere a supravieţuirii dupa terapia cu ITK, în comparaţie cu placebo (1, 21, 22)

Studiul ONCOBEL a arătat că 67% din eşantioanele tumorale au fost FISH pozitive (1, 23). Prezenţa amplificării prin creşterea numărului de copii, alături de mutaţii creşte proporţia de rezultate pozitive dupa tratamentul cu ITK.

RATA DE RĂSPUNS la tratamentul cu ITK este mai mare la pacienţii FISH pozitivi, faţă de cei FISH negativi (68% faţă de 9,1%) (24)

TIMPUL DE ABSENŢĂ AL PROGRESIEI TUMORII este mai lung la pacienţii FISH pozitivi (7,6 luni) faţă de cei FISH negativi (2,7 luni) (1, 4, 25).

Amplificarea numărului de copii împreună cu mutaţiile EGFR la pacienţii cu cancer pulmonar fără celule mici trataţi cu gefitinib au dus la un rezultat favorabil de 82% faţă de lotul martor de 11%.

Supravieţuirea a fost de 20,4 luni la cei cu mutaţii şi copii EGFR şi de 6,9 luni la lotul martor (4, 26).

Mutaţiile EGFR şi numărul crescut de copii sunt asociaţi cu bune rezultate clinice la cei trataţi cu gefitinib(4,25). În general copiile sunt un prezicător al timpului de absenţă al progresiei tumorii (4).

REZISTENŢA LA TRATAMENTUL CU ITK/EGFR

În cancerele cu mutaţii EGFR, dacă inhibăm EGFR prin ITK se opreşte activarea căilor de semnalizare dependente de EGFR. Reacţia celulei canceroase este de a căuta alte căi pentru a-şi menţine activitatea şi asfel apare rezistenţa.

Administarea îndelungată (8-9 luni până la 1-2 ani) duce la apariţia unei rezistenţe secundare, clinic manifestându-se prin recăderi.

Mecanismul apariţiei rezistenţei secundare:

1) APARE O MUTAŢIE SECUNDARĂ T790M (1, 28, 29). Aceasta apare la nivelul exonului 20 (1). Această mutaţie secundară afectează legătura reveresibilă dintre ITK şi grupul ATP/EGFR şi o face ineficientă (1, 10, 30, 31, 32). Apariţia rezistenţei se explică prin faptul că mutaţia T790M afectează legătura reversibilă dintre ITK şi grupul ATP-EGFR şi astfel se păstrează activitatea căilor de semnalizare din aval. Numai continuarea activităţii căii PI3K/AKT este suficientă pentru a produce rezistenţa la ITK (10, 33, 34, 35). Rezistenţa câştigată este asociată cu mutaţia secundară, ce duce la substituirea metioninei pentru threonină în poziţia T790M (10, 36). Avem asfel o rezistenţă secundară,care se face printr-o mutaţie de rangul 2 în alte site-uri (36).

S-a mai observat la exonul 21 şi o substituire de adenină pentru threonină în poziţia 854 (T854A), care inhibă fosforilarea EGFR-ATP(36).

La cei cu rezistenţă la tratamentul cu ITK se observă mutaţia secundară T790M în procent de 50% (1, 9, 27). Prezenţa mutaţiei T790M este cea mai comună, deşi s-au mai observat şi alte mutaţii la exonul 19-21 (1, 36, 37; 38).

Mutaţia T790M se observă la femei, nefumători şi la cei care au mutaţii prin deleţii (1).

2) Al doilea mecanism major pentru apariţia rezistenţei secundare este amplificarea oncogenei c-MET. Ea s-a observat la 20% din pacienţii cu rezistenţă secundară la tratamentul cu ITK-EGFR (1, 10, 32, 33, 36, 39).

C-MET este un receptor tyrosine-kinase.

Amplificarea c-MET activează cu ajutorul ErbB3 calea PI3K, independent de acţiunea EGFR. Acest lucru permite căilor de semnalizare din aval (dependente de EGFR) să continue activitatea în ciuda prezenţei ITK-EGFR (1, 40).

Amplificarea MET se întâlneşte independent de prezenţa mutaţei T790M, deşi pot fi şi simultan (1, 39, 40).

Amplificarea c-MET produce rezistenţă prin activarea căii PI3K-AKT dependentă de ErbB3 (39). Inhibând amplificarea c-MET putem restaura sensibilitatea la ITK (42).

Asfel tumorile canceroase devenite rezistente la tratamentul cu ITK prin mutaţiile secundare sunt dependente de activarea kinaselor, ce duc la proliferare celulară.

Nu s-au observat mutaţii secundare la pacienţii cu mutaţii Kras.

Fig. 5. Semnalizarea EGFR în mutaţiile din cancerul pulmonar fără celule mici la pacienţii cu sensibilitate sau rezistenţă la tratamentul cu inhibitori tyrosine-kinase EGFR

A) EGFR fosforilează ErbB3 pentru a activa la pacienţii cu cancer pulmonar fără celule mici şi sensibili la tratamentul cu Gefitinib sau Erlotinib. În asfel de cancere după tratamentul cu gefitinib sau erlotinib fosforilarea EGFR, ErbB3 şi AKT încetează.

B) Gefitinib sau Erlotinib sunt incapabili să inhibe fosforilarea EGFR în prezenţa mutaţiei T790M EGFR. Semnalizarea EGFR persistă în prezenţa Gefitinib sau Erlotinib ducând la persistenţa fosforilării ErbB3 şi AKT

C) c-Met poate deasemeni activa semnalizarea PI3K-AKT prin ErbB3. La pacienţii cu cancer pulmonar fără celule mici, odată cu amplificarea c-MET, gefitinib sau Erlotinib pot în continuare să inhibe fosforilarea EGFR , dar nu şi fosforlilareaErbB3. Acest lucru duce la o activare persistentă a semnalizării PI3K-AKT via ErbB3 întrun mod independent de EGFR.

D) Alte mecanisme posibile la rezistenţa faţă de gefitinib sau Erlotinib.

Aceste mecanisme potenţiale includ căi alternative pentru menţinerea semnalizării PI3K-AKT, fie prin oncogena PI3K ca şi prin alţi receptori ai kinazelor, care pot activa semnalizarea PI3K-AKT întrun mod independent de ErbB3. În asfel de cazuri Gefitinib sau Erlotinib pot inhiba fosforilarea EGFR şi ErbB3, dar nu şi fosforilarea AKT (P. S. Hammerman, Past A. Janne Bruce, E. Johnson - Clinical cancer research 2009; 15/24 : 7502)

MUTAŢIILE Kras

Mutaţiile la codonii 2, 12, 13 şi 63 duc la activarea proteinei ras şi permite celulei canceroase să crească indiferent de semnalizarea EGFR şi o face rezistentă la tratamentul cu ITK-EGFR (1, 43).

În cancerul pulmonar 95% din mutaţiile Kras se găsesc în codonii12 şi 13 (43).

Mutaţiile Kras la fumători apar prin transversie(se schimbă o purină cu o pirimidină şi vice-versa(G—T, G—C) (43, 44). Etiologia transversiei G—T la pacienţii cu cancer pulmonar este legată de efectul carcinogen al hidrocarburilor ciclice aromatice din tutun (43, 44, 45)

Transversia G—T nu este frecventă în Adeno-carcinomul cu mutaţii EGFR. În schimb prezenţa mutaţiilor Kras la nefumători se face prin tranziţie (se schimbă o purină cu altă purină sau o pirimidină cu o altă pirimidină (G—A).

Oncogena Kras mediază un mecanism alternativ prin activarea căii PI3K/AKT.

Activarea fiecarei gene duce la anormalităţi în semnalizarea comună (43).

Frecvenţa mutaţiilor Kras în ADC a fost de 9,7% (21 pacienţi din 215) şi a fost asociată cu fumatul şi cu gradingul histologic, şi anume sub forma slab diferenţată (43).

Mutaţiile Kras reprezintă:

15% la nefumători;

22% la foşti fumători;

25% la fumătorii activi.

Mutaţiile Kras se întâlnesc la 25% dintre persoanele din Europa sau USA şi sunt mai rare la Est-asiatici (1, 46).

Mutaţiile Kras cresc în frecvenţă la fumătorii cu ADC şi sunt rare la ADC de la nefumători (43, 47).

Mutaţiile Kras nu se corelează semnificativ cu : sex, vârstă şi istoria fumatului (1, 43).

Mutaţiile Kras sunt rezistente la tratamentul cu inhibitori ITK-EGFR (1, 36, 43) şi în urrma tratamentului cu chimioterapie adjuvantă răspund slab în privinţa supravieţuirii (43).

Mutaţiile Kras sunt exclusive cu mutaţiile EGFR (1, 11, 48, 49).

În privinţa rezultatelor la tratament deosebim:

a) Pacienţii cu mutaţii Kras - nu au beneficiu după tratamentul cu ITK-EGFR.

b) Pacienţii fără mutaţii Kras ( Kras sălbatic) au un câştig în privinţa supravieţuirii (1, 22).

Pacienţii cu mutaţii Kras trataţi cu ITK au o supravieţuire mai redusă decât cei trataţi cu chimioterapie (1, 50).

Mutaţiile Kras nu modifică timpul de lipsă a progresiei bolii, dar influenţează negativ supravieţuirea globală, în timp ce mutaţiile EGFR prelungesc timpul de lipsă al progresiei bolii, în comparaţie cu genele EGFR sălbatice (1, 51).

Mutaţiile Kras precum şi mutaţiile EGFR au capacitatea de a prezice,care va fi rezultatul în urma tratamentului cu ITK/EGFR sau rezistenţa la la acest tratament (1, 46, 51)

INHIBITORI IREVERSIBILI EGFR

Apariţia rezistenţei - după o perioadă de timp - la tratamentul cu inhibitori ai tyrosine-kinaselor a făcut necesară apariţia unor alte substanţe, care să păstreze acţiunea favorabilă, dar să evite apariţia rezistenţei.

Astfel au apărut inhibitori ireversibili ai tyrosine-kinazelor.

1) PELITINIB (RRB-569)

Ţinta acţiunii este EGFR. Doza maximă tolerată 75mgr. Reacţii adverse: diaree, greaţă, rash.

Pelitinib se leagă covalent, ireversibil de EGFR, ErbB2 şi ErbB4, inhibând fosforilarea EGFR şi semnalele de transducţie, ducând asfel la apoptoza şi suprimarea proliferării tumorale, care exprimă supra expresia acestor receptori (1, 52).

2) CANERTINIB (CI-1033).

Este un pan-Erb-tyrosine.kinase inhibitor. Este activ asupra celor 4 membri Erb. Ţinteşte EGFR şi inhibând ireversibil funcţiile de semnalizare a transducţiei se produce apoptoza şi suprimarea proliferării (1, 40).

3) AFATINIB (BIBW2992)

Este un inhibitor ireversibil,care ţinteşte EGFR şi ErbB2 (Her2). Prin acţiunea sa creşte timpul de lipsă al progresiei tumorii până la 14 luni. În schimb.rata de răspuns este de 58% şi reducera tumorii la 61%. Mutaţia T854A poate fi depăşită prin administrarea de BIBW 2992 (36)

4) XL647

Este un inhibitor potent al receptor tyrosine-kinaelor,care sunt implicate în proliferarea tumorii şi a vascularizaţiei tumorale (EGFR, Her2, VEGF).

Doza a fost de 350mgr. timp de 5 zile în 14 cicluri.Reacţii adverse: rash, diaree, greaţă.

S-au obţinut ameliorări clinice (40).

5) PF-00299801.

Este un inhibitor potent al mutaţiilor EGFR cu T790M. Este eficace în cancerele cu mutaţii sau amplificare a membrilor familiei ErbB. Este un inhibitor atât al ErbB2 sălbatic, cât şi al mutaţiei ErbB2 rezistentă la tratamentul cu ITK-EGFR (44, 54).

INHIBITORI IREVERSIBILI AI c-MET

1) MET-MAB

Este un unic anticorp monovalent,care se leagă de receporul c-Met şi previne fixarea Hepatocyte-growth factor pe receptorul Met, care, la rândul lui blochează stimularea receptorului şi astfel inhibă calea de semnalizare MET, (care poate fi activată în cancer).

Met-Mab combinat cu erlotinib la pacienţii cu cancer pulmonar fără celule mici ameliorează atât timpul fără progresie al bolii cat şi supra vieţuire globală

Pacienţii au fost împărţiţi în 2 grupe:

- primul grup a prezentat un nivel înalt MET,

- celalalt grup prezenta un nivel scăzut al MET. Doza a fost de 15mgr/kg.corp şi administare intra-venoasă.

Pacienţii cu Met supra-exprimat au răspuns favorabil – la tratamentul cu MED-MAB şi Erlotinib având timul de supravieţuire fără progresia bolii de 12 săptămâni, în comparaţie cu cei trataţi numai cu erlotinib unic sau cei cu placebo de numai 6,4 săptămâni.

La pacienţii cu expresia scăzută a MET rezultatul a fost foarte slab la toate cele 3 combinaţii (55).

2) ARQ 197are molecule mici si activează asupra MET (1);

3) XL184. Ţintele sale sunt Erb, MET, VEGFR2 (1).

Elementele care prezic răspunsul la tralmentul cu ITK sunt:

1) din punct de vedere clinic: sexul feminin, nefumătorii, est asiaticii.
2) din punct de vedere anatomo-patologic:

a) adeno-carcinomul bine diferenţiat (cu mutaţii EGFR);

b)adeno-carcinomul slab diferenţiat (cu mutaţii Kras).

3) din punct de vedere al mutaţiilor:

a) mutaţiile prin deleţii de la exonul 19;

b) mutaţiile punctiforme la exonul 21: mutaţia L858R.

4) din punct de vedere al localizării:
a) localizarea în zonele centrale bronhice; adenocarcinomul cu mutaţii Kras;

b) localizarea în zonele periferice - adenocarcinomul cu mutaţii EGFR.

CONCLUZII PRACTICE

1) Tratamentul cu inhibitori ai tyrosine-kinaselor trebuie considerat prima obţiune la cei cu mutaţii EGFR;

2) Testul mutaţiilor EGFR, al copiilor (amplificare) EGFR şi al mutaţiilor Kras este obligatoriu în tratamentul Adeno-carcinomului pulmonar cu inhibitori ai tyrosine-kinaselor EGFR.

3) În cancerul pulmonar fără celule mici majoritatea pacienţilor nu prezintă mutaţii EGFR (1).

GLOSAR

CODON: o secvenţă de trei nucleotizi alăturaţi constituind codul genetic şi care specifică poziţia structurală a unui amnoacid în lanţul de polipeptide în timpul sintezei de proteine.

DELEŢIE: aberaţie cromozomială constând în pierderea parţială sau totală al unui braţ al unui cromozom.

DIMER: o structură chimică formată din două subunităţi identice (monomer).

EXON: este o secvenţă de acid nucleic.

TRANSDUCŢIE:Transferul unei informaţii genetice de la o celulă la alta prin intermediul unui vector.

TRANSCRIPŢIE: etapă a exprimării unei gene în cursul căreia informaţia conţinută într-o secvenţă de ADN este copiată sub forma unei secvenţe de ARN.

AKT/PKB: este o serin-threonin protein kinase.Are rol în proliferarea celulară, apoptoză, transcripţie şi migrarea celulară.

ERK: extracelular signal-regulated kinases.

JAK: este o protein-kinase (Janus Kinase).

PI3K: Phosphoinositide3-kinase joacă un rol important în multe funcţiuni celulare. Un efector al PI3K este AKT. Activarea AKT duce la fosforilarea şi reglarea activităţii kinaselor,a factorilor de transcripţie şi alte molecule reglatorii.

STAT: the Signal Transducers and Activation of Transcription protein.

BIBLIOGRAFIE

1) J. Cadranel, G. Zalcman, L. Seqiist: Genetic profiling and epidermal growth factor receptor-directed therapy in nonsmall cell lung cancer. Eur. Resp. J. 2011; 183-193;

2) Fred R. Hirsch, M. Varella-Garcia, Rafal Dziaddzusko R.et al: Fluorescence in situ hybridisation sub group analysis of TRIBUTE, a phase III trial of Erlotinib plus Carboplatin and Paclitaxel in no small cell lung cancer Cl. Can. Res. 2008; 14:6317-5323;

3) Perez-Soler R.: Phase II clinical trial data with the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase erlotinib(OSI-774) in non small cell lung cancer. Clinic. Lung Cancer 2004, 6 Suppl.: S20-3;

4) L. V. Sequist, Daphe W. Bell, Thomas J. Lynch: Moleculars Predictors of response to Epidermal Growth Factor receptor Antagonist in non small cell lung cancer. J. of Clinical Oncology 2007; 25:587-595;

5) Lynch T. J., Bell D.W., Sardella R. et al: Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responseness of non small cell lung cancer to gefitinib. N. Eng. J. Med. 2004; 350:2129-2139;

6) Paez J.G., Janne P.A., Lee J.C. et al: EGFR mutations in lung can er corelation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004; 304:1497-1950;

7) Takano T., Ohe Y., Sakamoto M. et al: Epidermal growth factor receptor gene mutations and inceased coppy numbers predict gefitinib sensitivity in patients with recurrent non small cell lung cancer. J. of Clinical Oncolgy 2005; 23:6829-6837;

8)Han S. W., Kim T.Y., Hwang P.G. et al: Predictive and prognostic impact of epidermal growth factor receptor mutations in non small cell lung cancer patientstreated with gefitinib. J. Clin. Onc. 2005; 23:2493-2501;

9) Takayuki Akosaka-Yasushi, Yatabe Hideki Endow: Analysis of Epidermal growth factor receptor gene mutation in patients with non small cell lung cancer and aquired resistance to gefitinib. Clin. Cancer Resarch 2006; 17:5764-5709;

10) Peter S. Hammerman, Past A , Bruce E. Johnson: Resistance to epidermal growth factor receptor tyrosin-kinase inhibitors in non small cell lung cancer. Clinical cancer research 2009; 15:7508-7509;

11) Issaw Yee San Tam, Lap Ping Chung, Wai Sing Shen et al: Distinct Epidermal Growth Factor Receptor and KRAS Mutation Patterns in Non–Small Cell Lung Cancer Patients with Different Tobacco Exposure and Clinicopathologic Features. Clin Cancer Res March 1, 2006 12:1647-1653;

12) Bell D.W., Lynch T.J., Hasserlat: Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification in non small cell lung cancer:molecular analhysis of the IDEAL/INTACT gefitinib trials J. of Clinical Oncology 2005; 23:8081-8084;

13) Holbro T., Civenni G., Hynes N.F.: The ErbB recepors and their role in cancer progression Exp. Cell. Res. 2003; 284:93-110;

14) Engelman J.A., Janne P.A., Mermel C. et al: ErbB3 mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib sensitive non small cell lung cancer cell leines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005;102:3788-3793;

15) Sordella R., Bell A. W., Haberd. A. Settleman J. et al: Gefitinib sesitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti[apoptotric pathway. Science 2004; 305:1163-1167;

16) Tracy S., Mukohara T., Hansen M. et al: Gefitinib induced apoptosis imn the EGFR/L858R non small cell lung cancer cell-line H3255. Cancer Research 2004; 64:7241-7244;

17) Weinstein I.B.: CANCER Addiction to oncogenes-the Achhiles Heal of cancer. Science 2002; 297:83-84;

18) Fujimoto N., Wislez N. M., Zhang J. et al: High expression of ErbB familiy members and their ligands in lung adenocarcinomas that are sensitive to inhibition of epidermal growth factor receptor. Can. Researc. 2005; 65:11478-11485;

19) Capuzzo F., Hirsch F.R. ,Rossi E. et al: Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non small cell lung cancer. J. Natl. Cancer Inst. 2005;97:643-655.

20) Tsao M. S., Skurada A., Cutz J. C. et al: Erlotinib in lung cancer-molecular and clinical predictions of out-come. N. Eng. J. Med. 2005; 32:135-134;

21) Hirsch F.R.,Varella Garcia M., Bunn P.A. junior et al: Molecular prediction of out-come with gefitinib in a phase3-placebo controlled-study in advanced non small cell lung cancer. J. Clin. Oncology 2006; 24: 5034-5042;

22) Zhu C.Q., da Cunha Santos G., Ding K. et al: Role of Kras and EGFR as boi-markers of response to erlitinib in National Cancer Institute of Canada clinical Trial Group Study Br. 21. J. of Clin. Oncology 2008; 26:4268-4271;

23) Capuzzo F., Ligorio C. Janne P. A. et al: Prospective study of gefitinib in epidermal growth factor receptor,fluorescence in siti hybridisation-positive phospho-AKT positive in never smoker patients with advanced non small cell lung cancer. The Oncobel Trial; J. of Clinical Oncology 2007; 25:2248-2255

24) Niho S., Kubota K., Goto K. et al. First-line single agent treatment with gefitinib in patients with advanced non smll cell lung cancer. A phase II study. J. of. Clin. Oncology 2006; 84-89;

25) Douillard J., Shepherd F., Hirsch V. et al: Molecular predictors of out come with gefitinib and docetaxel inpreviously treated non small cell lung cancer: data from the radomized Phase III INTEREST trial. J. of Clin.Oncology 2010; 28:744-752;

26) Takano T., Ohe Y., Sakamoto H. et al: Epidermal growth factor receptor gene mutations and increased copy numbers predict gefitinib sesitivity in patients with recrrent non small cell lung cancer. J. of Clin Oncology 2005; 23:6829-6837;

27) Sequist L.V., Lynch T.: EGFR tyrosine kinase inhibitors in lung cancer: an evolving story Annu. Rev. Med. 2008; 59:429-442;

28) Balak M. N., Gong Y., Riely G. J. et al: Novel D76Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptor-mutated lung adeno [carcinomas with aquired resistance to kinase inhibitors]. Cli. Can. Rsearch 2006;12:6494-6501;

29) Pao W., Miller V.A.: Epidermal growth factor receptor mutations,small-molecule kinase inhibitors nand non small lung cancer: current knowledge and future directions. J. of Clin. Oncology 2005; 23:2556-2568;

30) Yun C. H., Mengwasser K. E., Tom A. V. et al: The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinityb for ATP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008;105:2070-2075;

31) Fujimoto N., Wislez M., Zhang J. et al: High expressionb of ErbB familiy members and their ligands in lung adeno-carcinomas that are sensitive to inhibition of epidermal growth factor receptor. Cancer Research 2005; 65;11478-11485;

32) Capuzzo F., Varella-Garcia M., Shigematsu H. et al: Inceased Her2 gene copy number is associated with response to gefitinib therapy in the epidermal growth factor receptor-positive nonsmall cell lung cancer. J. of Clin Oncology 2005; 23:5007-5018;

33) Wang S.E., Narasanna A., Perez-Torres et al: Her2 kinase domain mutation results in consitutive phosphorylation of Her2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine–kinase inhibitors. Cancer Cell 2005;10:25-38;

34 )Subramanian J. J., Govindan R.: Molecular genetics of lung cancer in people who have never smoked. Cancer Oncol 2008; 9:676-682;

35) Ellis I. M., Hicklin D. J.: Resistance to targeted therapies:refining anti-cancer therapy in the era of molecular oncology. Clin. Can. Research 2009;15:7471-7478;

36) Bean J., Riely G. J., Balak M.: Aquired resistance to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors associated with a novel T854A mutation in a patient with EGFR mutant Lung carcinoma. Clin. Can. Research 2008; 14:7519-7525;

37) YANG C. J., Chao T. J., Shin J. et al: Use of BIBW2992 a novel irreversible EGFR KTI to induce regression in patrients with adenocarcinoma of the lung and acivatinf EGFR mutations: preliminary results of a single arm phase II clinical trial. J. of Clinical Oncology 2008; :8026-;

38) Kobayashi S., Boggon T.J., Dayaram T. et al: EGFR mutations and resistance on non small cell lung cancer to gefitinib. New. Engl. J. Med 2005; 352:786-792;

39) Engelman J.A., Zengmullahu K., Mitsudani T. et al: Met amplication leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ErbB3 signaling. Science 2007; 316:1039-1043;

40) Janne P.A., von Pawel J., Cohen R.B. et al: Multicenter, radomized, phase II trials of CI-1033 on irreversible pan-ERBB inhibitor, for previously treated advanced non small cell lung cancer. J. of. Clinical Oncology 2007; 25:3936-3944;

41) Bean J., Brennan C., Shin J. Y. et al: MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with aquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc .Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104:20932-20937;

42) Pantaleo, M. A., Nannini M. A., Maleddu et al: Experimental result and related implcations of PET detection of epidermalgrowth factor receptor (EGFR) in cancer. Annals. Oncol. 2009; 20:213-226;

43) Riely G. J., Kris M. G., Rosenbaum D. et al: Frequence and distinctive spectrum of Kras mutations in never smokers with lung adenocarcinoma. Clin. Can. Research 2008;14:5731-5734;

44) Engelman J. A., Zejnullahu K., Mitsubomi T.: MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science2007; 316:1039-1045;

45) Jie Oi, Michele A. Metigue, Andrew Rogers: Multiple mutations and bypass mechanism can contribute to dev elopment of aqiuired resistance to MET inhibitors Cancer Research 2011;71:1081;

46) Pao W., Wang T. Y., Riely T. J., et al: Kras mutation and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PloS MED 2005;2;e1;

47) Nelson H. H., Christiani D. C., Mark E. J.et al Implications and prognostic value of Kras mutations for early-stage lung cancer in women. J. Natl. Cancer Institute 1999; 91:2032-2038;

48) Kosaka T., Yatabe Y., Endoh H. et al: Mutation of the epidermal growth factor receptor gene in lungcancer: biological and clinical implications. Cancer Research 2004; 64:8915-8923;

49) Tam I. Y., Chung I. P., Suen W. S. et al: Distinct epidermal growth factor receptor and Kras mutation patterns in non small cell lung cancer patientst tobacco exposure and clinico-pathologic features. Clin. Can.Research 2006;12:1647-1653;

50) Eberhard D. A., Johnson B. E., Amler L. C. et al: Mutations in the epidermal growth factormreceptor and in Kras are predictive and prognostic indicators in patients with che, motherapy alone and in combination with erlotinib. J. of Clin. Oncology 2005;23:5900-5909;

51) Cadranel J., Lizard S., Mauguen A. et al: Impact of clinical and biological markers on progression-free survival (PFS) and overal survival in patients (pts) with adanced non small cell lung cancer (NSCLC) treated by erlotinib results of the ERMETIC cohort. www.meet.ics.com/wcl2009/pdf/Posterdiscussion Session-sunday 2 AUGUST 2009.PDF. Data last accessed September 30, 2010. Date last updated:August 2, 2009;

52) Charles Eichman, Manuel Hidalgo, Joseph P. Boni et al: Phase I study of EKB-569 an irreversible inhibitor of the epidermal growth factor receptor in patients with advanced solid tumors. J. of Clin. Oncology 2006;24/15:2252-226;

53) Dr. Shiris Gadgeel: Post abstract P3-134. The 12 international association for the study of lung cancer. World conference of lung cancer Seoul, South Korea;

54) Gonzales A. J., Hook K. E., Althaus I. W. et al: Anti-tumor activity and pharmacokinetic properties of PF-00299804, a second generation irreversible pan ErbB receptor kinase inhibitor. Mol. Cancer Therap. 2008, 7:1880-188;

55) Roxanne Nelson: METMAB added to erlotinib improve survival in a subset of patients with Lung Cancer. MEDSCAPE MEDICAL NEWS 2010 oct 9, Milan, Italy.